全自動蛋白免疫印跡處理系統在實驗中可能出現的常見問題主要包括信號弱或無信號、背景高、多帶現象、條帶異常等，以下是對這些問題的詳細分析：
信號弱或無信號
一抗和二抗不匹配：二抗需和一抗宿主的物種相同，例如一抗來自鼠，二抗則應是抗鼠抗體。
抗體濃度不足：使用高濃度抗體，并在4℃條件下延長孵育時間，如過夜孵育。
封閉劑與抗體交叉反應：使用溫和的去污劑如吐溫-20，或更換封閉劑（如脫脂奶粉、BSA、血清、明膠）。
一抗不識別待檢物種的蛋白：參照說明書，對比免疫原序列和蛋白序列，確保抗體和目的蛋白會發生反應，并設置陽性對照。
蛋白上樣量不足：每條泳道蛋白上樣量一般不超過20μg，使用蛋白酶抑制劑并設置陽性對照。
轉膜不充分：使用可逆染色劑檢測轉膜效果，檢查轉膜操作是否正確，如PVDF膜需預先浸在甲醇中，然后浸到轉移緩沖液中。
一抗失效：使用新鮮抗體，避免重復使用導致有效濃度降低。
二抗受疊氮鈉抑制：避免疊氮鈉和HRP標記抗體一起使用。
檢測試劑盒過期或底物失活：使用新鮮的底物。
背景高
未進行特異性封閉或封閉不充分：延長封閉時間，考慮更換合適的封閉劑。
一抗或二抗濃度過高：稀釋抗體至合適濃度，或以更高稀釋度抗體延長孵育時間。
二抗與封閉劑非特異性結合或反應：設置二抗對照（不加一抗）。
未結合蛋白質洗滌不充分：增加洗滌次數。
膜干燥：在孵育過程中防止膜變干，每一步都要保證膜有充分的反應液，可放入攪拌子不斷攪動或輕輕震蕩使膜浸在溶液中。
選膜不當：硝酸纖維素膜（NC膜）比PVDF膜背景低，可根據實驗需求選擇合適的膜。
多帶現象
細胞傳代次數過多，蛋白表達不同：使用原始未傳代的細胞株，和現在的細胞株一起做平行對照實驗。
體內表達的蛋白樣本具有多種修飾形式：如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等，可使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來證明翻譯后的修飾。
蛋白樣本降解：在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。
檢測到未經報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結構不同的蛋白：查閱其他文獻報道，或使用BLAST搜尋，使用說明書推薦的細胞株或組織。
一抗濃度過高：降低抗體濃度和/或孵育時間。
條帶異常
背景有不均勻的白色斑點：轉膜時膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均，轉膜過程中應盡量去除氣泡，抗體孵育時保持搖動。
背景有黑色斑點：抗體結合了封閉劑，可過濾封閉劑。
深背景出現白色條帶：一抗或二抗加入過多，應稀釋抗體的濃度。
目的條帶染色過低/過高，分離不徹底：改變凝膠比例，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠。
條帶“微笑”效應：遷移過快或電泳溫度過高改變了pH值和遷移速度，可降低遷移速度或低溫電泳（如在冷庫或冰上進行）。
相同蛋白雜交出現不均勻條帶：制備凝膠時凝膠凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均勻，可參照凝膠的配方，在凝膠中加入適量TEMED，放置時在凝膠頂部加入適量1%SDS（水稀釋）以防凝膠變干。
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